Genómové sekvencie väčšiny vírusov sú známe.Sondy nukleových kyselín, ktoré sú krátkymi segmentmi DNA navrhnutými na hybridizáciu s komplementárnymi segmentmi vírusovej DNA alebo RNA.Polymerázová reťazová reakcia (PCR) je účinnejšou technikou na detekciu vírusov.Nedávno boli vyvinuté vysoko výkonné diagnostické metódy.
A. Technika hybridizácie nukleových kyselín
Hybridizácia nukleových kyselín, hlavne zahŕňajúca Southern blotting (južné) a Northern blotting (severné), je rýchlo sa rozvíjajúca nová technika v oblasti diagnostiky vírusov.Dôvodom hybridizačného testu je použitie krátkych segmentov DNA (nazývaných „sonda“) navrhnutých na hybridizáciu s komplementárnymi segmentmi vírusovej DNA alebo RNA.Zahriatím alebo alkalickým spracovaním sa dvojvláknová cieľová DNA alebo RNA rozdelí na jednotlivé vlákna a potom sa imobilizujú na pevnom podklade.Potom sa pridá sonda a hybridizuje sa s cieľovou DNA alebo RNA.Keďže sonda je označená izotopom alebo nerádioaktívnym nuklidom, cieľovú DNA alebo RNA možno detegovať autorádiografiou alebo systémom biotín-avidín.Keďže väčšina vírusových genómov bola klonovaná a sekvenovaná, možno ich detegovať pomocou vírusovo špecifických sekvencií ako sond vo vzorke.V súčasnosti hybridizačné metódy zahŕňajú: dot blot, in situ hybridizáciu v bunkách, DNA blotting (DNA) (Southern blot) a RNA blot (RNA) (Northern blot).
Technológia B.PCR
V posledných rokoch bola vyvinutá séria in vitro techník amplifikácie nukleových kyselín založených na PCR na testovanie necitlivých alebo nekultivovateľných vírusov.PCR je metóda, ktorá môže syntetizovať špecifickú sekvenciu DNA in vitro polymerázovou reakciou.Proces PCR zahŕňa tepelný cyklus troch krokov: denaturácia, žíhanie a predlžovanie Pri vysokej teplote (93 °C~95 °C) sa dvojvláknová DNA rozdelí na dva jednoduché vlákna DNA;potom sa pri nízkej teplote (37 °C~60 °C) dva syntetizované nukleotidové priméry anelujú na komplementárne segmenty DNA;zatiaľ čo pri vhodnej teplote pre enzým Taq (72 °C) začína syntéza nových reťazcov DNA od 3' konca priméru s použitím komplementárnej DNA ako templátov a jednotlivých nukleotidov ako materiálov.Takže po každom cykle môže byť jeden reťazec DNA zosilnený na dva reťazce.Opakovaním tohto procesu môže byť každý reťazec DNA syntetizovaný v jednom cykle použitý ako templát v ďalšom cykle a počet reťazcov DNA sa v každom cykle zdvojnásobí, čo znamená, že produkcia PCR je zosilnená rýchlosťou 2n log.Po 25 až 30 cykloch sa produkcia PCR identifikuje elektroforézou a špecifické produkty DNA možno pozorovať pod UV svetlom (254 nm).Pre svoju výhodu špecifickosti, citlivosti a výhodnosti bola PCR prijatá v klinickej diagnostike mnohých vírusových infekcií, ako sú HCV, HIV, CMV a HPV.Keďže PCR je veľmi citlivá, dokáže detekovať vírusovú DNA na úrovni fg, operácia by sa mala vykonávať veľmi opatrne, aby sa predišlo falošne pozitívnemu výsledku.Okrem toho pozitívny výsledok testu nukleových kyselín neznamená, že vo vzorke je živý infekčný vírus.
So širokým použitím techniky PCR sa vyvíjajú nové techniky a metódy založené na technike PCR na rôzne účely testovania.Napríklad kvantitatívna PCR v reálnom čase môže detekovať vírusovú záťaž;in situ PCR sa používa na identifikáciu vírusovej infekcie v tkanive alebo bunkách;Nested PCR môže zvýšiť špecifickosť PCR.Spomedzi nich sa rýchlejšie vyvinula kvantitatívna PCR v reálnom čase.Mnoho nových techník, ako je hydrolyzačná sonda TaqMan, hybridizačná sonda a sonda molekulárneho majáku, bolo skombinovaných do kvantitatívnej PCR techniky v reálnom čase, ktorá sa široko používa v klinickom výskume.Okrem presnej identifikácie vírusovej záťaže v telesných tekutinách pacientov sa táto metóda môže použiť aj na detekciu mutanta tolerantného voči liekom.Preto sa kvantitatívna PCR v reálnom čase používa hlavne pri hodnotení liečebného účinku a sledovaní tolerancie liekov.
C. Vysokovýkonná detekcia vírusových nukleových kyselín
Na uspokojenie potrieb rýchlej diagnostiky nových vznikajúcich infekčných chorôb boli zavedené rôzne vysokovýkonné metódy detekcie, ako sú DNA čipy (DNA).Pre DNA čipy sa syntetizujú špecifické sondy a pripájajú sa k malým kremíkovým čipom vo veľmi vysokej hustote, aby vytvorili DNA sondu microarray (DNA), ktorá môže byť hybridizovaná so vzorkou.Signál hybridizácie môže byť zobrazený konfokálnym mikroskopom alebo laserovým skenerom a ďalej spracovaný počítačom a je možné získať obrovský súbor údajov týkajúcich sa rôznych génov.Existujú dva druhy DNA čipov.Syntetický čip je nasledujúci: špecifické oligonukleotidy sa syntetizujú priamo na čipoch.Ďalším je DNA pool chip.Klonované gény alebo produkty PCR sa usporiadane vytlačia na sklíčko.Výhodou technológie DNA čipov je súčasná detekcia obrovského množstva DNA sekvencií.Najnovšia verzia čipu na detekciu patogénov dokáže identifikovať viac ako 1700 ľudských vírusov naraz.Technológia DNA čipov vyriešila problémy tradičných metód hybridizácie nukleových kyselín a má veľmi široké uplatnenie vo vírusovej diagnostike a epidemiologickej štúdii.
Čas odoslania: 23. decembra 2020